对于电化学生物传感器，生物传感元件在基体电极表面的固定化一直是该领域的研究热点之一。电极表面固定化技术决定了电化学生物传感器的性能和应用价值。
什么是共价键合法？
目前，适合生物传感器的常用固定化方法有夹心法、包埋法、吸附法、共价键合法、交联法和微胶囊法等。其中，使生物活性分析通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法称共价键合法。
共价键合法主要载体有哪些？
固定化酶常用载体包括：
天然高分子：纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等
合成高聚物：尼龙、多聚氨基酸、乙烯一顺丁烯二酸酐共聚物等
无机载体：多孔玻璃、石墨、金属氧化物等，无机载体使用较少。
共价键合法优缺点有哪些？
共价键合法的优点：酶与载体间连接牢固，即使用高底物浓度或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体分离。因此具有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。
共价键合法的缺点：反应条件的控制要求比较苛刻。在反应剧烈、操作复杂的条件下，常常会引起酶蛋白高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难于保证制备的重复性，不是每次都能获得高活力的固定化。
共价键合法优缺点
酶与载体共价键合的主要方法
酶与载体共价键合有3种方式：
1.与载体直接反应连接；
2.通过同源双功能试剂与载体连接；
3.通过异源双功能试剂与载体连接后再与载体反应连接。
确定选择哪一种方法，需要了解酶的氨基酸残基的反应性、出现频率和可接近性。
此外，根据酶与载体之间的共价结合形式可以划分为重氮法、肽键法、烷化法等。
共价键合法举例
（a）重氮法；（b）肽键法；（c）烷化法
有效保护活性中心的方法
在酶的共价固定中，尤其要注意保护活性中心的氨基酸。如果活性中心的氨基酸残基在共价固定过程中被化学修饰，酶活性会下降。有效保护活性中心的方法有两种。
方法一：在共价反应之前加入酶的底物或底物结构类似物或竞争性抑制剂，将活性中心保护起来。
方法二：结合使用共价反应的化学选择性和生物特异性异源双功能试剂。这种双重选择性在某些条件下不仅能保护蛋白质活性部位，还可能实现酶分子的定向固定。已经掌握了多种反应类型可以用于这种选择。
共价键合法主要用途
共价结合法多用于酶膜和免疫分子膜的制作，通常要求在低温（0℃）、低离子强度和生理pH条件下操作，并常常加入酶的底物以防止酶的活性部位与载体发生键合。在血糖监测领域，如今大火的持续血糖监测（CGM）系统作为生物传感器应用在医疗器械领域的代表，在其传感器制备过程中，为提高CGM表面化学修饰层固定化效率，柏医健康自主研发了半自动化生物膜交联机（BEAuLink-100）、水平方向涂膜机（BEAuCoX-100）、垂直方向涂膜机（BEAuCoY-100），实现了CGM工件的表面生物膜自动固定化。
柏医健康自主研发半自动化生物膜交联机（BEAuLink-100）
以半自动化生物膜交联机（BEAuLink-100）为例，该设备主要是通过交联剂的均匀挥发，将生物膜牢固地交联固定于电极表面，并且能通过调节涂膜腔温度、 转子的运动速度，交联次数等参数， 来控制固定化生物层的生物层性能。主要特点包括：
- 循环水浴保温，节能高效，稳定性好；
- 铝合金转子，轻巧耐用；
- 交联腔内温度、湿度可测；
- 交联剂料舟盘易取易放易清洗；
- 定时工作，自动结束蜂鸣报警。
参考文献：
[1] 高先恩.生物传感器[M].化学工业出版社,2005.
[2] 李晔.酶的固定化及其应用[J].分子催化,2008,22(1).
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